多色(se)免(mian)疫熒(ying)光(guang)染色試劑(ji)盒使(shi)用(yong)說(shuo)明

　　酪酰胺信(xin)號(hao)放(fang)大(TSA，Tyramide signal amplification)技(ji)術是(shi)壹類(lei)利用(yong)辣(la)根(gen)過氧化酶(HRP)對靶蛋(dan)白進行標(biao)記的(de)酶學(xue)檢測(ce)方法，類(lei)似常規免(mian)疫組(zu)化的(de)DAB顯(xian)色(se)方(fang)法 ，TSA技(ji)術同(tong)樣(yang)采用(yong)HRP標(biao)記的(de)二抗，同(tong)樣(yang)有(you)對應(ying)的(de)“顯(xian)色(se)"步(bu)驟(HRP催(cui)化加入反應(ying)體(ti)系(xi)的(de)酪胺熒(ying)光(guang)素(su)底(di)物(wu)，產生(sheng)活(huo)化熒(ying)光(guang)底(di)物(wu)，活(huo)化底物(wu)可與(yu)抗(kang)原上的(de)酪氨酸(suan)等殘(can)基共(gong)價(jia)結合(he)，使樣品上穩定(ding)的(de)共價(jia)結合(he)酪胺熒(ying)光(guang)素(su)。之(zhi)後用(yong)熱(re)修復(fu)法洗去(qu)非共價(jia)結合(he)的(de)壹抗(kang)-二(er)抗-HRP復(fu)合物(wu)，重復(fu)下(xia)壹種(zhong)壹抗(kang)-hrp二(er)抗來第(di)二(er)輪孵(fu)育，換(huan)另壹種(zhong)酪胺熒(ying)光(guang)素(su)底(di)物(wu)，如此(ci)往(wang)復(fu)就(jiu)可實(shi)現多重(zhong)標(biao)記。

　　TSA詳(xiang)細(xi)原理是(shi)利用(yong)酪胺Tyramide的(de)過氧化物(wu)酶反(fan)應(ying)(酪胺鹽(yan)在(zai)HRP催(cui)化H202下形(xing)成共價(jia)鍵結合(he)位(wei)點(dian))，產生大量的(de)酶促(cu)產(chan)物(wu)，該(gai)產物(wu)能與(yu)周(zhou)圍(wei)的(de)蛋(dan)白殘基(ji)(包(bao)括色氨(an)酸(suan)、組(zu)氨(an)酸和酪氨酸(suan)殘基)結(jie)合，這(zhe)樣在(zai)抗原-抗體(ti)結合部(bu)位就(jiu)有(you)大量的(de)熒(ying)光(guang)素(su)沈(chen)積，結果(guo)使其檢測(ce)信號(hao)得(de)到(dao)10-100倍(bei)增(zeng)強。簡單來說(shuo)，用(yong)這(zhe)種方(fang)法做(zuo)多重免(mian)疫熒(ying)光(guang)是(shi)利用(yong)二(er)抗(kang)上帶有(you)的(de)HRP(而(er)不是(shi)直(zhi)接(jie)偶聯熒(ying)光(guang)素(su))，來催(cui)化後續(xu)添(tian)加入體系(xi)的(de)非活(huo)性(xing)熒(ying)光(guang)素(su)。熒(ying)光(guang)素(su)在(zai)HRP和過氧化氫的(de)作用(yong)下(xia)被(bei)活(huo)化，跟臨(lin)近蛋(dan)白的(de)酪氨酸(suan)殘基共(gong)價(jia)偶聯，使得蛋(dan)白樣品(pin)與(yu)熒(ying)光(guang)素(su)穩(wen)定結合(he)。然後微波(bo)或煮沸(fei)或者水浴等熱(re)修復(fu)處(chu)理(li)，前(qian)壹輪(lun)非(fei)共價(jia)結合(he)的(de)抗體被(bei)洗掉(diao)，共價(jia)結合(he)的(de)熒(ying)光(guang)素(su)穩(wen)定共價(jia)結合(he)在(zai)樣本(ben)切(qie)片(pian)蛋(dan)白上。再換(huan)個壹抗(kang)來第(di)二(er)輪孵(fu)育，周(zhou)而(er)復始。等到(dao)所有(you)抗體(ti)孵(fu)育結(jie)束(shu)，熒(ying)光(guang)素(su)都(dou)結合好(hao)後，最後去(qu)檢測(ce)結果(guo)。由(you)於(yu)每次體系(xi)中(zhong)都(dou)只有(you)單壹抗(kang)體(ti)孵(fu)育，因(yin)此(ci)無需(xu)擔(dan)心(xin)抗(kang)體(ti)交(jiao)叉反(fan)應(ying)，以及壹抗(kang)二(er)抗種(zhong)屬(shu)匹(pi)配問(wen)題，大大減少了(le)實(shi)驗(yan)設計(ji)時不同(tong)種(zhong)屬(shu)抗(kang)體選(xuan)擇匹(pi)配的(de)限制。也就(jiu)是(shi)說(shuo)，如果(guo)用(yong)TSA技(ji)術，同(tong)壹張(zhang)片(pian)子上所有(you)的(de)靶標都可以選(xuan)用(yong)特(te)異性(xing)高的(de)兔單克隆抗(kang)體(ti)。搭(da)配(pei)同(tong)壹支抗兔的(de)HRP二抗就(jiu)可以進行實(shi)驗(yan)，而(er)且信(xin)號(hao)放(fang)大的(de)倍(bei)數大大增(zeng)強。茹創生物(wu)開(kai)發(fa)的(de)試劑(ji)盒具(ju)體酪胺熒(ying)光(guang)染料(liao)為(wei)以下其中(zhong)壹種(zhong)或者多種：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此(ci)試劑(ji)盒中(zhong)的(de)熒(ying)光(guang)染料(liao)可單(dan)獨(du)或配合使用(yong)。可以實現單標(biao)、雙(shuang)標(biao)、三標(biao)以及更多(duo)重熒(ying)光(guang)放(fang)大(da)/多重同(tong)源(yuan)抗體(ti)熒(ying)光(guang)標(biao)記等功能(neng)，極(ji)大(da)豐(feng)富(fu)了此(ci)試劑(ji)盒的(de)內涵(han)。

　　試劑(ji)盒組(zu)成：

　　產品(pin)名(ming)稱(cheng)規格(ge)保 存(cun)備註(zhu)

　　TYR-520熒(ying)光(guang)染料(liao)(綠光)(即用(yong)型)5mL-20℃TYR-520熒(ying)光(guang)染料(liao) 、TYR-570熒(ying)光(guang)染料(liao) 、TYR-690熒(ying)光(guang)染料(liao) 在(zai)-20度下(xia) ，均(jun)為固(gu)體(ti)，使(shi)用(yong)之(zhi)前(qian)需解(jie)凍(dong)。

　　TYR-570熒(ying)光(guang)染料(liao)(紅(hong)光)(即用(yong)型)5mL-20℃

　　TYR-690熒(ying)光(guang)染料(liao)(即(ji)用(yong)型)5mL-20℃

　　TSA+增(zeng)強劑(ji)100ul-20℃(可選(xuan))

　　高敏多(duo)聚hrp山羊抗(kang)兔二抗5mL4℃

　　TSA+增(zeng)強劑(ji)使用(yong)方(fang)法：TSA+增(zeng)強劑(ji)能夠進壹步(bu)增(zeng)強熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)放(fang)大液(ye)的(de)放大信號(hao)5-10倍(bei)，TSA+增(zeng)強劑(ji)：TYR熒(ying)光(guang)放(fang)大(da)液(ye)=1:500，使用(yong)TSA+增(zeng)強劑(ji)不是(shi)必須的(de)選(xuan)項，可以根(gen)據具(ju)體的(de)情況選(xuan)擇添(tian)加或者不選(xuan)擇添(tian)加。

　　操(cao)作(zuo)流(liu)程(cheng)：

　　1、 石(shi)蠟(la)切(qie)片(pian)脫蠟(la)至水：依次(ci)將(jiang)切(qie)片(pian)放入二甲(jia)benⅠ15min-二(er)甲benⅡ15min-無水(shui)乙(yi)醇(chun)Ⅰ5min-無水(shui)乙(yi)醇(chun)Ⅱ。取出(chu)放在(zai)通風廚(chu)內，酒精(jing)晾幹(gan)後放(fang)入自來水(shui)中(zhong)稍(shao)洗，蒸(zheng)餾水(shui)洗。

　　2、 抗(kang)原修復(fu)：組(zu)織(zhi)切(qie)片(pian)置(zhi)於(yu)盛(sheng)滿PH 9.0 EDTA堿(jian)性(xing)抗(kang)原修復(fu)液(ye)或者PH6.0檸檬(meng)酸(suan)修復(fu)緩(huan)沖(chong)液(ye)的(de)修復盒中(zhong)於(yu)微波(bo)爐(lu)內進行抗(kang)原修復(fu)(也可以用(yong)高壓(ya)1-2min 100度水煮(zhu)15min 95度(du)水浴(yu)20min等其他(ta)熱(re)修復(fu)方法)。中火(huo)8min，停(ting)火(huo)8min，轉(zhuan)中(zhong)低(di)火7min，此過程中應(ying)防(fang)止緩(huan)沖(chong)液(ye)過度蒸發，切(qie)勿幹(gan)片(pian)。自然冷卻(que)後將(jiang)玻(bo)片(pian)置(zhi)於(yu)PBS(PH7.4)中(zhong)在(zai)脫色(se)搖(yao)床上晃動(dong)洗滌(di)3次，每次5min。(修復液(ye)和修復條件根(gen)據組(zu)織(zhi)類(lei)型以及抗原類(lei)型來確(que)定(ding))。

　　3、 阻(zu)斷內源(yuan)性(xing)過氧化物(wu)酶：切(qie)片(pian)放入3%過氧化氫溶液(ye)，室溫避光(guang)孵(fu)育15 min，將(jiang)玻(bo)片(pian)置(zhi)於(yu)PBS(PH7.4)中(zhong)在(zai)脫色(se)搖(yao)床上晃動(dong)洗滌(di)3次，每次5min。

　　4、 BSA封閉:切(qie)片(pian)稍(shao)甩幹(gan)後用(yong)組(zu)化筆(bi)在(zai)組(zu)織(zhi)周圍(wei)畫(hua)圈(quan)(防止抗體(ti)流(liu)走(zou))，在(zai)圈(quan)內滴(di)加用(yong)3%BSA-PBS(或者其他(ta)封閉液(ye))均勻覆(fu)蓋組(zu)織(zhi)，室溫封閉30min。

　　5、 加(jia)壹抗(kang)：輕(qing)輕甩掉封閉液(ye)，在(zai)切(qie)片(pian)上滴加(jia)用(yong)抗(kang)體(ti)稀(xi)釋液(ye)稀(xi)釋好(hao)的(de)的(de)壹抗(kang)X，切(qie)片(pian)平放(fang)於(yu)避(bi)光(guang)濕(shi)盒(he)內4°C孵(fu)育過夜或者37度1-2h。(濕盒(he)內加(jia)少量水防(fang)止抗體(ti)蒸發(fa))

　　6、 加hrp二抗：玻(bo)片(pian)置(zhi)於(yu)PBS(PH7.4)中(zhong)在(zai)脫色(se)搖(yao)床上晃動(dong)洗滌(di)3次，每次5min。切(qie)片(pian)稍(shao)甩幹(gan)後在(zai)圈(quan)內滴(di)加與(yu)壹抗(kang)相應(ying)種(zhong)屬(shu)的(de)hrp二抗覆(fu)蓋組(zu)織(zhi)，避光室溫孵(fu)育50min，PBS洗三次(ci)。

　　7、 熒(ying)光(guang)染料(liao)反(fan)應(ying)：TYRXXX熒(ying)光(guang)染料(liao)反(fan)應(ying)10-15min，PBS洗三次(ci)。

　　8、 重(zhong)復2-7步(bu)驟(換(huan)用(yong)另外壹種(zhong)TYRXXX熒(ying)光(guang)染料(liao))

　　9、 DAPI復(fu)染細(xi)胞核(he)：玻(bo)片(pian)置(zhi)於(yu)PBS(PH7.4)中(zhong)在(zai)脫色(se)搖(yao)床上晃動(dong)洗滌(di)3次，每次5min。切(qie)片(pian)稍(shao)甩幹(gan)後在(zai)圈(quan)內滴(di)加DAPI染液(ye)，避光室溫孵(fu)育10min。

　　10、 封(feng)片(pian)：玻(bo)片(pian)置(zhi)於(yu)PBS(PH7.4)中(zhong)在(zai)脫色(se)搖(yao)床上晃動(dong)洗滌(di)3次，每次5min。切(qie)片(pian)稍(shao)甩幹(gan)後用(yong)抗(kang)熒(ying)光(guang)淬滅(mie)封片(pian)劑(ji)封片(pian)。

　　11、 鏡檢拍照(zhao)：切(qie)片(pian)於(yu)熒(ying)光(guang)顯(xian)微鏡(jing)/共(gong)聚(ju)焦(jiao)/多通道熒(ying)光(guang)掃(sao)描儀/多(duo)光譜成像系(xi)統(tong)下(xia)觀(guan)察並采集(ji)圖(tu)像。

　　染料(liao)激(ji)發波(bo)長(chang)發(fa)射(she)波(bo)長(chang)

　　DAPI 藍色350420

　　TYR-480450480

　　TYR-520綠色490520

　　TYR-570紅(hong)色550570

　　TYR-620590620

　　TYR-690630690

　　TYR-780750780

　　文章(zhang)引用(yong)試劑(ji)盒/方(fang)法：Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit (Guduo Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.