產品描(miao)述

        HRbio™ miRNA qPCR Kit采(cai)用(yong) SYBR Green I嵌合熒光法的原(yuan)理進行(xing)miRNA的熒(ying)光定(ding)量(liang)檢(jian)測(ce)。本(ben)產(chan)品(pin)包含miRNA qPCR所(suo)需要(yao)的(de)所(suo)有試(shi)劑(ji)，組(zu)分分別(bie)是：2×miRNA qPCR Mix和(he)Reverse primer。其(qi)中(zhong)2×miRNA qPCR Mix（含(han)SYBR Green）是專(zhuan)門(men)為(wei)miRNA熒光定(ding)量(liang)檢(jian)測(ce)而特(te)別(bie)研(yan)發的新(xin)壹(yi)代預(yu)混液(ye)形(xing)式的qPCR試(shi)劑。其(qi)中(zhong)DNA polymerase采(cai)用(yong)的是抗(kang)體(ti)修飾(shi)的(de)熱啟(qi)動(dong)形式，配(pei)合特(te)殊(shu)的buffer體系，使(shi)得反應(ying)特(te)異(yi)性更好，靈(ling)敏度更高，並且(qie)在(zai)更廣的(de)範(fan)圍內(nei)進(jin)行(xing)準確(que)定(ding)量(liang)。

qPCR系列(lie) 蛋白(bai)與免(mian)疫熒光定(ding)量(liang)PCR試(shi)劑盒 產品組(zu)分

運(yun)輸(shu)與保(bao)存方法

1.-20°C 避光保(bao)存至少 12 個(ge)月，使(shi)用(yong)前充分融(rong)解混勻。

2.2 ×miRNA qPCR Mix(With Sybr Green)短(duan)期(qi)使(shi)用(yong)可(ke)放(fang)在(zai) 4°C，避免反復(fu)凍(dong)融。

3.Reverse primer(10μM )每(mei)次用(yong)完置(zhi)-20°C 保(bao)存。

註意事(shi)項(xiang)

1.miRNA 第壹鏈(lian)cDNA 的加(jia)入量(liang)不(bu)要(yao)超(chao)過real time PCR 體積1/10。

2.對於(yu)特(te)殊(shu)的檢(jian)測(ce)體(ti)系中(zhong)，高(gao)含(han)量(liang)的(de)cDNA 模板易導(dao)致(zhi)非特(te)異(yi)性擴(kuo)增(zeng)，根(gen)據所(suo)檢(jian)測(ce)miRNA 的(de)豐度適當的稀釋(shi)cDNA（5-10倍或(huo)者100倍(bei)）。

3.本品中(zhong)含(han)有(you)熒(ying)光染(ran)料(liao)Sybr Green I，保(bao)存本品或(huo)配(pei)制(zhi)PCR反應(ying)液(ye)時(shi)應(ying)避免強(qiang)光照(zhao)射。

4.2 x miRNA qPCR Mix不(bu)含(han)參比染(ran)料(liao)ROX，客(ke)戶(hu)並根(gen)據qPCR儀器(qi)技術(shu)指(zhi)導(dao)決(jue)定(ding)是否(fou)需(xu)要(yao)加(jia)ROX參(can)比(bi)染(ran)料(liao)，用(yong)於(yu)消(xiao)除(chu)信號本(ben)底(di)以(yi)及(ji)校正(zheng)孔與孔之(zhi)間(jian)產生(sheng)的熒光信號誤(wu)差(cha)

5.為(wei)了您(nin)的安(an)全(quan)和健康(kang)，請穿(chuan)實驗服(fu)並戴壹次(ci)性手(shou)套(tao)操(cao)作(zuo)。

6.本產(chan)品僅(jin)作(zuo)科(ke)研(yan)用(yong)途！

操(cao)作(zuo)步驟(zhou)

1. 在(zai)室溫(wen)融化(hua)2 ×miRNA qPCR Mix和(he)Reverse primer（10μM）。

2. 使(shi)用(yong)時(shi)請將2 ×miRNA qPCR Mix上下顛倒(dao)輕輕均(jun)勻混合，避免起(qi)泡，並經(jing)輕微(wei)離(li)心後(hou)使(shi)用(yong)。如果(guo)試劑(ji)沒(mei)有(you)混勻，其反應(ying)性能會(hui)有(you)所(suo)下降。註：請不(bu)要(yao)使(shi)用(yong)振蕩(dang)器混勻。

3. 按照(zhao)下表組(zu)分冰(bing)上進行(xing)反應(ying)液(ye)的(de)配(pei)制(zhi)：

【註】： 使(shi)用(yong)前務(wu)必(bi)充分混勻， 避免劇(ju)烈(lie)震(zhen)蕩(dang)產生過(guo)多(duo)氣(qi)泡。

a) 引物濃(nong)度：通常引(yin)物終濃(nong)度為(wei)0.2 μM，也可(ke)以根據情(qing)況在(zai)0.1- 1.0 μM之(zhi)間(jian)進行(xing)調整(zheng)。

b) 模板濃(nong)度：如(ru)模板類型(xing)為(wei)未(wei)稀(xi)釋(shi)cDNA原(yuan)液(ye)，使(shi)用(yong)體積(ji)不(bu)應(ying)超(chao)過qPCR反應(ying)總(zong)體(ti)積的(de)1/10。

c) 模板稀釋(shi)：cDNA原(yuan)液(ye)建(jian)議5- 10倍稀釋(shi)，最(zui)佳模板加(jia)入量(liang)以(yi)擴增(zeng)得到的(de)CT值在20-30個(ge)循環為(wei)好。

d) 反應(ying)體(ti)系：推(tui)薦使(shi)用(yong)20μL或50 μL ，以(yi)保(bao)證(zheng)目(mu)的(de)基(ji)因擴增(zeng)的(de)有(you)效(xiao)性和(he)重(zhong)復(fu)性。

e) 體(ti)系配(pei)制(zhi)：請於(yu)超(chao)凈(jing)工作(zuo)臺內(nei)配(pei)制(zhi)，並使(shi)用(yong)無核(he)酸(suan)酶殘(can)留的(de)槍(qiang)頭、反應(ying)管(guan)；推(tui)薦使(shi)用(yong)帶濾(lv)芯(xin)的(de)槍頭。避免交(jiao)叉(cha)汙(wu)染(ran)和(he)氣(qi)溶(rong)膠(jiao)汙(wu)染(ran)。

 qPCR系列(lie) 蛋白(bai)與免(mian)疫熒光定(ding)量(liang)PCR試(shi)劑盒

PCR 循環（三步法）

PCR 循環（二(er)步法）

【註】高特(te)異(yi)性可(ke)選(xuan)擇兩(liang)步法，高效(xiao)率擴(kuo)增(zeng)可(ke)選(xuan)擇三步法。

a)  預變性時(shi)間(jian)： 根據不(bu)同模板和引物的具(ju)體(ti)情(qing)況可(ke)適當縮短(duan)至 2 min。

b)  退火溫度和(he)時(shi)間(jian)：請根(gen)據引物和目(mu)的(de)基(ji)因的長度進(jin)行(xing)調整(zheng)。

c)  熒光信號采(cai)集(ji)（★）：請按照(zhao)儀(yi)器使(shi)用(yong)說明書要求進(jin)行(xing)實驗程(cheng)序(xu)設(she)置，幾(ji)種(zhong)常(chang)見儀器(qi)的時(shi)間(jian)設(she)定(ding)如(ru)下：

30sec 以上： Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec 以上：Applied Biosystems: 7300

34sec 以上： Applied Biosystems: 7500

d)  熔(rong)解曲線： 通常情(qing)況下可(ke)以使(shi)用(yong)儀器(qi)默認(ren)程(cheng)序(xu)。